Title: Laboratorio interattivo: Il DNA

[Image: FdS2021]

Laboratorio interattivo: Il DNA

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[Image: DNA]

[Image: DNA: precipitazione]

[Image: DNA: precipitazione con interfaccia]

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a cura di
Rosarita Tatè (IGB)
Raffaele Palomba (ISPAAM)
con la collaborazione di
Pietro Amodeo (ICB)

[Image: logo ICB]

[Image: logo ISPAAM]

[Image: logo IGB]

[Image: CNR]

Cominciamo dai concetti di base!

Domande di base a scelta singola

Q: Il DNA (acido deossiribonucleico), la molecola depositaria delle informazioni genetiche in tutti gli organismi viventi, è:
- una molecola polimerica a doppia catena antiparallela, orientata, complementare, spiralizzata, le cui unità sono chiamate nucleotidi. Ogni nucleotide è formato da una base azotata, uno zucchero con 5 atomi di Carbonio (il D-2-deossiribosio) e un gruppo fosfato. Le catene sono avvolte nello spazio intorno a un asse virtuale, in senso destrorso, in modo da formare una doppia elica. (correct)
- una molecola polimerica con struttura a tripla elica formata da una sequenza di amminoacidi contenente ripetizioni del tipo glicina-prolina-X e glicina-X-idrossiprolina, dove X è un qualsiasi altro amminoacido.
- una molecola polimerica con una struttura a doppia elica formata da catene di molecole di zucchero (ad es. glucosio).

Q: Il ruolo fondamentale del preciso ordine di successione delle basi azotate del DNA è di determinare:
- l’ordine di successione degli amminoacidi nelle proteine codificate dal DNA, secondo una regola che viene designata "codice genetico". (correct)
- il grado di resistenza al calore (stabilità termica) del DNA.
- il grado di piegatura e quindi la struttura tridimensionale del DNA.

Q: Le basi azotate nel DNA:
- sono 4: adenina, guanina, timina, citosina. (correct)
- sono 20: alanina, arginina, asparagina, acido aspartico, cisteina, fenilalanina, glicina, acido glutammico, glutammina, isoleucina, istidina, leucina, lisina, metionina, prolina, serina, tirosina, treonina, triptofano, valina.
- sono 2: ribosio e desossiribosio.

Q: Dove si trova solitamente il DNA di una cellula eucariota che non sia in fase di duplicazione:
- all’interno del nucleo e di alcuni particolari organelli cellulari, come i mitocondri e i cloroplasti. Per poter restare in uno spazio microscopico come quello del nucleo, la doppia elica di DNA deve super-avvolgersi in maniera estremamente precisa e ben strutturata, anche grazie al contributo di proteine nucleari specializzate. (correct)
- nella parte esterna della cellula, dove si ripiega attraversando la membrana cellulare più volte. In questo modo può legarsi a molecole che vengono dall'esterno e trasmettere "messaggi" all'interno della cellula in base alla natura delle molecole riconosciute.
- all'interno della cellula, avvolto su se stesso e intorno a proteine (come un rocchetto di cotone) in modo da realizzare strutture a forma di "X", note come cromosomi.

La descrizione errata del DNA come proteina a tripla elica corrisponde invece al collagene (proteina strutturale fondamentale, rappresentando la principale proteina del tessuto connettivo negli animali, nonché quella più abbondante nei mammiferi, dove costituisce circa il 25% della massa proteica totale e, nell'uomo, circa il 6% del peso corporeo), mentre quella come polisaccaride a doppia elica corrisponde ad una delle strutture dell'amilosio, una delle componenti principali dell'amido, il caboidrato di riserva delle piante. In verità, esistono anche strutture proteiche a doppia elica, come nel caso della proteina tropomiosina, ma sono casi rari in confronto con le proteine, o più spesso, parti di proteine, che assumono struttura elicoidale (di cui la forma di gran lunga più diffusa è la cosiddetta "alfa-elica").

La successione delle basi in una sequenza di DNA può infuenzarne anche la struttura locale e la stabilità termica, e ciò può rivestire differenti gradi di importanza in vari casi, ma questi aspetti sono nettamente secondari rispetto al ruolo di conservazione e trasferimento dell'informazione genetica.

Anche negli RNA, le basi azotate sono 4, ma oltre alla sostituzione dello zucchero deossiribosio con il ribosio, la differenza con il DNA è la sostituzione della base azotata timina con uracile.

La risposta sbagliata sul numero di basi del DNA = 20 contiene la lista dei 20 amminoacidi codificati nel DNA delle cellule eucariote.

Diversamente dalle cellule eucariotiche, in quelle batteriche (procariotiche) il DNA è localizzato in una specifica regione cellulare, ma non strutturalmente distinta come il nucleo.

Se il contenuto di DNA di una singola cellula fosse completamente disteso, sarebbe lungo ben 2 metri.

A differenza di quanto spesso si pensa, i cromosomi si formano solo durante il processo di duplicazione cellulare e rappresentano una forma molto ripiegata "da viaggio" del DNA (come per i nostri vestiti, che devono essere protetti e stirati o piegati ma ben accessibili nell'armadio, e sono ulteriormente ripiegati, compattati e messi in valigia sono quando dobbiamo viaggiare). Il DNA nel nucleo, per quanto protetto e ripiegato, non può essere troppo ripiegato perché deve essere continuamente "srotolato" localmente e trascritto in mRNA per poter produrre le proteine che codifica.

Per la sua delicatezza e importanza, il DNA non potrebbe mai trovarsi all'esterno della cellula: le molecole che si ripiegano attraversando più volte la membrana e riconoscono le molecole esterne, trasformandoli in messaggi interni alla cellula sono proteine specializzate, note come recettori.

Ora passiamo alle fasi del laboratorio!

Trova gli estranei

Trova i 4 estranei nella lista dei materiali richiesti per il lab
(senza sbirciare nella scheda!!!)

- un campione di materiale biologico........................ - farina
      (frutta/ortaggi/carne/pesce/saliva) ................................ - piccoli contenitori di plastica o di vetro
- forchetta e piattino di plastica................................. - lampada-UV
- imbuto............................................................................ - garza o carta da filtro
- siringa monouso seza ago........................................ - stuzzicadenti/paletta del caffè
- zucchero........................................................................  - sale fino da cucina
- aceto..............................................................................  - detersivo liquido per piatti
- alcol denaturato........................................................... - colorante blu alimentare (opzionale)
A: farina; lampada-UV; zucchero; aceto

La farina e lo zucchero non contengono DNA, nè sono ingredienti richiesti dalla procedura.

Il DNA è una molecola delicata, quindi non ama i raggi UV (perciò usiamo le creme solari!). Tra l'altro, per osservare effetti di fluorescenza visibili sul DNA bisogna usare coloranti particolari che non fanno parte dei reagenti previsti dal nostro laboratorio "casalingo".

Seleziona con un click gli ingredienti estranei e poi controlla con "Verifica"

Ora passiamo alle fasi del laboratorio!

Riordina le fasi dell'estrazione del DNA!

Qualcuno ha messo in disordine il nostro quaderno di laboratorio.
Trascina e scambia le differenti fasi dell'esperimento per disporle nell'ordine giusto.

Q: Si comincia con la [...], cioè la rottura meccanica dei tessuti vegetali o animali, seguita dalla [...] per liberare il DNA dalle cellule, per poi procedere alla [...] per eliminare i detriti cellulari dalla miscela ottenuta. Ora si potrà effettuare la [...] con alcol freddo, per poi procedere alla [...] all'interfaccia tra le de fasi. Infine, con l’aiuto di uno stuzzicadenti, potremo effettuare il [...].
A: DISGREGAZIONE; LISI; FILTRAZIONE; PRECIPITAZIONE del DNA; VISUALIZZAZIONE del DNA; RECUPERO del DNA

Quello che, se tutto è andato bene, vedrete a fine esperimento sono migliaia di molecole di DNA raggruppate insieme: una singola molecola sarebbe infatti troppo piccola per essere visualizzata a occhio nudo, e per osservarla sarebbe necessario un microscopio elettronico.