Title: Un indagine Metabolomica: sulle tracce delle "molecole colpevoli"

[Image: Sfondo metabolomica alimentare]

Esegui tutte le attività per verificare le tue conoscenze.

Istruzioni
(per visualizzarle premi il pulsante sotto)

Alla ricerca delle “impronte molecolari del colpevole”:
l’analisi metabolomica per caratterizzare l’interazione
tra piante e loro agenti patogeni

Alla fine di ogni attività, se non compare automaticamente il risultato (punti e "stellina"), controllalo con il pulsante "Verifica" in fondo alla finestra. Se il contenuto è tagliato e/o il pulsante non è visibile, scendi con la barra di scorrimento sulla destra della finestra. Alla fine delle attività di una pagina, vai alla successiva con le frecce in basso o usando la barra, sempre in basso, che si colorerà di blu per le pagine già superate. L'ultima pagina mostrerà il riepilogo dei risultati e consentirà di visualizzare le soluzioni o di ripetere il percorso. Anche se hai risposto bene a tutto, attiva "Mostra soluzione" nell'ultima pagina e, in ogni pagina, nell'angolo del quiz svolto comparirà un piccolo fumetto violetto con un punto interrogativo bianco. Se lo selezioni, riceverai informazioni e spiegazioni aggiuntive!

Buon lavoro!

[Image: logo ICB]

a cura di:  Pietro Amodeo, Salvatore Donadio

Biancamaria Ciasca, Veronica M.T. Lattanzio, Antonio F. Logrieco

[Image: logo ISPA]

Scaldiamo i motori: hai le idee chiare sui Metaboliti Secondari?

I Metaboliti Secondari: domande a scelta singola

Q: Un "metabolita secondario" è:
- una molecola ritenuta strettamente non indispensabile per la crescita e lo sviluppo, ma che può avere ruoli importanti nella difesa, comunicazione e trasmissione di segnali. (correct)
- una molecola che non ha alcuna importanza per le cellule e gli organismi.
- una molecola prodotta a partire da un "metabolita primario".

Q: I "metaboliti secondari" sono:
- molecole molto più piccole delle proteine e del DNA. (correct)
- molecole più grandi delle proteine e del DNA.
- piccole e medie proteine.

NOTA CHE la definizione di "metabolita secondario" può variare nel tempo, perché le conoscenze sul loro ruolo, la loro indispensabilità e la loro origine sono soggette ai risultati delle ricerche in continua evoluzione.

[Image: Metaboliti secondari 1]

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[Image: Metaboliti secondari 2]

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Scaldiamo i motori: hai le idee chiare sulla Cromatografia?

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La Cromatografia: domande a scelta singola

Q: La "cromatografia" è una tecnica di separazione di molecole:
- che si basa sulla loro diversa capacità di essere trattenute da un materiale che riempe una colonna (la "fase stazionaria") quando un flusso continuo di fluido (liquido o gas, la "fase mobile" o eluente) la attraversa. (correct)
- in base al colore.
- in base al rapporto tra la loro carica elettrica e la loro massa quando sono fatte passare attraverso campi elettrici e magnetici dopo essere state rese cariche (ionizzate).

Q: La "fase mobile" della cromatografia è:
- un liquido o gas che viene fatto scorrere attraverso la colonna cromatografica per trascinare a differente velocità le diverse molecole del campione. (correct)
- la molecola del campione che si muove più velocemente nel corso dell'esperimento.
- una parte dell'esperimento in cui si agita la colonna cromatografica.

NOTA CHE la fase mobile può essere costituita da un gas, nel qual caso si parlerà di "gascromatografia", abbreviata in GC, o da un liquido, che darà origine alla "cromatografia allo stato liquido" o, più semplicemente, "cromatografia liquida", abbreviata in LC, dall'inglese "liquid chromatography".

[Image: LC 1]

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[Image: LC 2]

Scaldiamo i motori: hai le idee chiare sulla Spettrometria di Massa?

[Image: MS 1]

La Spettrometria di Massa: domande a scelta singola

Q: La "spettrometria di massa" è una tecnica di separazione e identificazione di molecole:
- in base al rapporto tra la loro carica elettrica e la loro massa (peso molecolare) quando sono fatte passare attraverso campi elettrici e magnetici dopo essere state rese cariche (ionizzate). (correct)
- in base alla loro abbondanza nel campione.
- basata sulla diversa capacità di molecole dotate di massa differente di diffrangere la luce.

Q: Se durante un esperimento di spettrometria di massa una o più molecole si spaccano in frammenti:
- li posso usare come se fossero "tratti somatici" (occhi, capelli, naso,...) per identificare in modo più preciso le molecole e i "gruppi funzionali" che sono presenti in esse. (correct)
- dovrò ripetere l'esperimento, finchè non osserverò che non si formano più frammenti.
- potrò utilizare solo i dati delle molecole che non si spaccano.

NOTA CHE lo spettrometro di massa, sia che «frammenti» ciascuna molecola, sia che strappi o aggiunga elettroni alla molecola intera (trasformandolo nel cosiddetto "ione molecolare"), ci fornirà il rapporto massa/carica degli ioni che si generano, che, nel caso di frammenti, produrrà informazioni sui gruppi funzionali caratteristici di ciascuna molecola.

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[Image: MS 2]

Passiamo alle fasi del metodo di indagine sulle molecole "sospette"!

Vediamo se le riconosci... per ora in ordine sparso...

[Image: IDENTIFICAZIONE DELLE MOLECOLE]

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IDENTIFICAZIONE DELLE MOLECOLE

Q: Fase di "Identificazione delle molecole":
- Assegnare un nome alle nostre molecole utilizzando tutti gli indizi a disposizione. (correct)
- Scoprire nuove molecole finora sconosciute.
- Scoprire le proprietà chimiche delle nostre molecole.

NOTA CHE in questa fase è importante individuare il massimo numero di molecole, note o nuove che siano, per sperare di comprendere i processi biologici che avvengono negli organismi e nelle condizioni in esame.

Passiamo alle fasi del metodo di indagine sulle molecole "sospette"!

Vediamo se le riconosci... per ora in ordine sparso...

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ANALISI IN CROMATOGRAFIA LIQUIDA ACCOPPIATA ALLA SPETTROMETRIA DI MASSA

Q: Fase di "Analisi in Cromatografia liquida accoppiata alla Spettrometria di Massa":
- Separare e identificare i Metaboliti:

 - in CROMATOGRAFIA LIQUIDA (LC), in base alla loro diversa “affinità” tra la fase stazionaria della colonna e la fase mobile che passa attraverso di essa;

- in SPETTROMETRIA DI MASSA (MS) in base al rapporto massa/carica della molecola o dei frammenti che ne possono derivare. (correct)
- Separare e identificare i Metaboliti:

 - in CROMATOGRAFIA LIQUIDA (LC), in base alla loro diversa solubilità in un liquido;

- in SPETTROMETRIA DI MASSA (MS) in base al rapporto massa/carica della molecola o dei frammenti che ne possono derivare.
- Separare e identificare i Metaboliti:

- in CROMATOGRAFIA LIQUIDA (LC), in base alla loro diversa “affinità” tra la fase stazionaria della colonna e la fase mobile che passa attraverso di essa;

- in SPETTROMETRIA DI MASSA (MS) in base alle diverse masse e colori delle molecole.

NOTA CHE la formazione di frammenti nello spettrometro di massa dipende in parte dalla natura delle molecole e del campione, in parte dalla nostra scelta di metodi, cioè se riteniamo utile o meno avere anche i frammenti o le informazioni sulla sola molecola intera possano essere sufficienti.

[Image: Analisi in Cromatografia liquida accoppiata alla Spettrometria di Massa]

Passiamo alle fasi del metodo di indagine sulle molecole "sospette"!

Vediamo se le riconosci... per ora in ordine sparso...

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RICERCA IN BANCA DATI

Q: Fase di "Ricerca in Banca Dati (DB)":
- Consultare gli "schedari" (banche dati) contenenti i «profili segnaletici» di ciascun «potenziale sospetto» (molecola) per confrontarli con i dati ricavati dagli esperimenti. (correct)
- Consultare gli "schedari" (banche dati) contenenti le informazioni su tutte le possibili "bande" (miscele di molecole) per riconoscere direttamente quella "colpevole" dal confronto con i dati ricavati dagli esperimenti.
- Consultare le banche dati contenenti le composizioni di tutte le piante sane, infette e dei microorganismi patogeni, per confrontarli con i dati ricavati dagli esperimenti.

NOTA CHE le combinazioni di metaboliti secondarie, considerando anche le loro diverse possibili combinazioni, sono infinite e quindi non potremmo mai realizzare la banca dati di riferimento che ci servirebbe e ancor meno fare ricerche in essa. Analogamente, il numero di possibili composizioni in metaboliti diverse presenti nelle varie varianti, condizioni di crescita (età, salute, nutrimento, illuminazione,...) e grado di infezione in una data pianta sono virtualmente infinite. Pertanto, le analisi si eseguono per individuare ciascuna molecola, confrontando con i dati presenti in banca dati su tutti i composti conosciuti nella categoria di molecole che stiamo studiando, e poi si applicheranno metodi matematici e statistici per riconoscere e confrontare le miscele.

[Image: Ricerca in Banca Dati (DB)]

Passiamo alle fasi del metodo di indagine sulle molecole "sospette"!

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DISEGNO SPERIMENTALE

Q: Fase di "Disegno sperimentale":
- Pianificare come «condurre l’indagine», avendo ben chiaro in mente l'obiettivo dell’indagine: cosa vogliamo scoprire? Nel nostro caso, i colpevoli sulle "scene del crimine" (insiemi di molecole che caratterizzano i vari ceppi e stati di salute della pianta) (correct)
- Scegliere la tecnica sperimentale per «condurre l’indagine», che dipende solo dalla pianta che vogliamo studiare.
- Scegliere l'esperimento più veloce e meno costoso per «condurre l’indagine», dipende solo dal microorganismo patogeno.

NOTA CHE, per un sistema/problema non ancora ben esplorato, le combinazioni di metodi, strumenti e procedure (i "protocolli sperimentali") vanno studiati, provati, modificati e ottimizzati caso per caso. Esistono protocolli standard che descrivono "casi" ben studiati e caratteristici di problemi molto diffusi, ma questi sono i "punti di arrivo" di una ricerca come la nostra, che, oltre a caratterizzare "colpevoli" e "scene del crimine", vuole anche trovare metodi per riconoscere velocemente le differenti "scene" tra loro.

[Image: Disegno sperimentale]

Passiamo alle fasi del metodo di indagine sulle molecole "sospette"!

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ANALISI STATISTICA

Q: Fase di "Analisi statistica":
- Per scovare gli elementi più importanti di ciascuna «banda», che in alcuni casi potranno essere comuni a più «bande»: si scelgono gli insiemi di "sospetti" (molecole) che globalmente differiscono di più tra le diverse scene del crimine. (correct)
- Per scovare gli elementi più importanti di ciascuna «banda», che in alcuni casi potranno essere comuni a più «bande»: si scelgono gli insiemi di "sospetti" (molecole) che sono più abbondanti in tutte le diverse scene del crimine.
- Per scovare gli elementi più importanti di ciascuna «banda», che in alcuni casi potranno essere comuni a più «bande»: si scelgono gli insiemi di "sospetti" (molecole) che sono comuni a tutte le diverse scene del crimine.

NOTA CHE, mentre non è detto che ci siano singoli "sospetti" (molecole) presenti su una sola "scena del crimine", ci saranno combinazioni di essi (i principali elementi delle "bande") che si troveranno solo su ciascuna delle scene del delitto. Le analisi statistiche servono proprio a identificare queste combinazioni e a capire quanto siano davvero uniche e rappresentative di una "scena". Nota anche come la composizione della "banda" da sola in genere non spiega i meccanismi biologici che agiscono sulle varie "scene" e che sono responsabili delle diverse condizioni e risposte degli organismi.

[Image: Analisi statistica]

Passiamo alle fasi del metodo di indagine sulle molecole "sospette"!

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INTERPRETAZIONE BIOCHIMICA

Q: Fase di "Interpretazione biochimica":
- Individuare il ruolo delle molecole identificate all’interno della pianta e quali siano le vie metaboliche coinvolte, per meglio comprendere i fenomeni di tolleranza e resistenza nelle diverse linee, nonché i processi di infezione. (correct)
- Individuare solo le molecole che danneggiano la pianta e il loro contenuto nelle varie linee e stati di salute della pianta.
- Comprendere solo a che servono le molecole più abbondanti ritrovate nei diversi campioni.

NOTA CHE non sempre le molecole più abbondanti o quelle più direttamente coinvolte nei danni agli organismi sono quelle più interessanti o importanti per capire i meccanismi di attacco degli organismi patogeni o di difesa/resistenza delle piante!

[Image: Interpretazione biochimica]

Passiamo alle fasi del metodo di indagine sulle molecole "sospette"!

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CONVERSIONE ED ELABORAZIONE DEI DATI

Q: Fase di "Conversione ed elaborazione dei dati":
- Trasformazione delle informazioni ottenute con i nostri metodi sperimentali e loro «ripulitura» dai dati non necessari, rispettivamente per permettere la loro lettura dai software usati nei passaggi successivi e per conservare solo gli indizi utili al riconoscimento di tutti i «presenti». (correct)
- Trasformazione delle informazioni ottenute con i nostri metodi sperimentali e loro «ripulitura» dai dati che non concordano con quello che ci attendevamo, rispettivamente per permettere la loro lettura dai software usati nei passaggi successivi e per conservare solo gli indizi che confermano le nostre ipotesi sul riconoscimento di tutti i «presenti».
- Trasformazione delle informazioni ottenute con i nostri metodi sperimentali e loro «ripulitura» dai dati noti, rispettivamente per permettere la loro lettura dai software usati nei passaggi successivi e per eliminare le molecole già note dalla nostra analisi.

NOTA CHE è sbagliato affrontare un problema nuovo, ma anche una semplice verifica di un'ipotesi, con preconcetti e idee già formate su ciò che sia giusto o sbagliato, presente o assente. Manipolare o semplicemente cancellare dati non coerenti con le nostre idee o aspettative è una vera e propria frode scientifica! Nel problema che stiamo trattando, poi, le molecole note possono essere altrettanto e anche più utili di quelle finora sconosciute!

[Image: Conversione ed elaborazione dei dati]

Passiamo alle fasi del metodo di indagine sulle molecole "sospette"!

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PREPARAZIONE DEL CAMPIONE

Q: Fase di "Preparazione del campione":
- Estrarre i metaboliti dal mais in soluzione.
I nostri "sospetti" sono metaboliti secondari presenti nella pianta (mais).
Occorre “estrarli” ovvero separarli dalle altre classi di molecole (proteine, DNA, polisaccaridi,...), portarli via dalla pianta e scioglierli tutti in una soluzione che verrà poi analizzata. (correct)
- Estrarre tutte le molecole dal mais.
I nostri "sospetti" sono tutte le molecole presenti nella pianta (mais).
Occorre “estrarli” ovvero portarli via dalla pianta e scioglierli tutti in una soluzione che verrà poi analizzata.
- Estrarre le proteine dal mais in soluzione.
I nostri "sospetti" sono le proteine presenti nella pianta (mais).
Occorre “estrarle” ovvero separarle dalle altre classi di molecole (metabolit secondari, DNA, polisaccaridi,...), portarle via dalla pianta e scioglierle tutti in una soluzione che verrà poi analizzata.

NOTA CHE, mentre è molto probabile che anche l'analisi di altre molecole delle cellule di mais (come le proteine) possa fornire indicazioni simili a quelle dei metaboliti secondari sullo stato di salute e sulla resistenza delle piante, la nostra ipotesi di lavoro (che gli esperimenti potrebbero anche smentire: questo è il "bello" della ricerca!) è che i metaboliti secondari siano una spia affidabile di ciò che ci interessa. Infatti, l'analisi dei metaboliti secondari può essere resa più facilmente rapida, economica e riproducibile di quella di componenti più complesse, e lo scopo finale del nostro studio (oltre ad una miglior conoscenza dei problemi e sistemi studiati) sarebbe di individuare un metodo con quelle caratteristiche per distinguere e classificare le piante e le loro condizioni di salute.

[Image: Preparazione del campione]

E ora... il gran finale!!!

Ma qualcuno ha sabotato le indagini rimescolando le fasi...

Aiutandoti con la casella vuota grigia centrale con la X arancione, sposta le immagini e rimetti in ordine il protocollo!

- [Image: Disegno sperimentale]
- [Image: Preparazione del campione]
- [Image: Analisi in LC accoppiata alla MS]
- [Image: Conversione ed elaborazione dei dati]
- [Image: Analisi statistica]
- [Image: Ricerca in banca dati]
- [Image: Identificazione delle molecole]
- [Image: Interpretazione biochimica]
Q: Step 1
A: [Image: Disegno sperimentale]
Q: Step 2
A: [Image: Preparazione del campione]
Q: Step 3
A: [Image: Analisi in LC accoppiata alla MS]
Q: Step 4
A: [Image: Conversione ed elaborazione dei dati]
Q: Step 5
A: [Image: Analisi statistica]
Q: Step 6
A: [Image: Ricerca in banca dati]
Q: Step 7
A: [Image: Identificazione delle molecole]
Q: Step 8
A: [Image: Interpretazione biochimica]
Q: Casella di Appoggio